《实用免疫细胞与核酸》附录四 实验室常用技术参数资料

化合物分子量λmax(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.71

2．常用核酸的长度与分子量

核酸核苷酸数分子量λDNA48502（双链环状）3.0×107pBR3224363（双链）2.8×10628SrRNA48001.6×10623SrRNA37001.2×10618SrRNA19006.1×10519SrRNA17005.5×1055SrRNA1203.6×104tRNA（大肠杆菌）752.5×104

3．常用核酸蛋白换算数据

（1）重量换算

1μg=10-6g　 1pg=10-12g

1ng=10-9g 　1fg=10-15g

（2）分光光度换算：

1A260双链DNA=50μg/ml

1A260单链DNA=30μg/ml

1A260单链RNA=40μg/ml

（3）DNA摩尔换算：

1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端

1μg pBR322 DNA=0.36pmol

1pmol 1000bp DNA=0.66μg

1pmol pBR322=2.8μg

1kb双链DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿

1kb单链DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿

1kb单链RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿

（4）蛋白摩尔换算：

100pmol分子量100，000蛋白质=10μg

100pmol分子量50，000蛋白质=5μg

100pmol分子量10，000蛋白质=1μg

氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿

（5）蛋白质/DNA换算：

1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质

10，000MW蛋白质=270bp DNA

30，000MW蛋白质=810bp DNA

50，000MW蛋白质=1.35kb

100，000MW蛋白质=2.7kb DNA

4．常用蛋白质分子量标准参照物

（1）高分子量标准参照（2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500β-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脱氢酶55，000抑制剂　磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶`57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200　　抑制剂　肌球蛋白（F3）2，500　　溶菌酶14，400　　

5．常用DNA分子量标准参照物

λDNA/HindⅢλDNA/EcoRⅠλ/HindⅢ+EcoRⅠpBR322/HaeⅢ23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564　190423451125　158421321　　137519218　　97418411　　8311247　　564　　　　125　　

续上表

pBR322/HinfⅠφχ174/HinfⅠφχ174/Hae Ⅲφχ174/TapⅠ1631726140135329145177131181078117550655310087240439650082603327344417663102312984134828114122131142271872202494023454154200241943375151　11820　　　72　

1．分子克隆常用缓冲液

2．磷酸缓冲液

（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※

pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2

（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※

pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8

※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：

pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

在此，pK’=6.86(25℃)。

3．电泳缓冲液

测序凝胶加样缓冲液

98%去离子甲酰胺

10mol/L EDTA(pH8.0)

0.025%二甲苯青FF

0.025%溴酚蓝

甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/L Tris-乙酸50×：242gTris碱　0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸　　100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/L Tris-磷酸10×:10gTris碱　0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）　　40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/L Tris-硼酸5×：54gTris碱　0.001mol/L EDTA27.5硼酸　　20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1×:50mmol/L NaOH1×:5ml 10mol/L NaOH　1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1×:25mmol/L Tris5×:15.1gTris　250mmol/L 甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）　0.1% SDS50ml 10% SDS(电泳级)

说明：

①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。

进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

②碱性电泳缓冲液应现用现配。

③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2×SDS凝胶加样缓冲液：

100mmol/L Tris·HCl(6.8)

200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

4%SDS（电泳级）

0.2%溴酚蓝

20%甘油

不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

4．凝胶加样缓冲液

缓冲液类型6×缓冲液贮存温度Ⅰ0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液Ⅱ0.25溴酚蓝室温0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)Ⅲ0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液Ⅳ0.25%溴酚蓝4℃40%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTAⅤ18%聚蔗糖(Ficoll400)4℃0.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF

使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

5．各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25℃）0.1mol/L HCl的体积7．145．77．244．77．343．47．442．07．540．37．638．57．736．67．834．57．932．08．029．28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0

某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml

（2）温度对50mmol/LTris·HCl液pH值的影响

4℃25℃37℃8．17．57．28．27．67．38．37．77．48．47．87．58．57．97．68．68．07．78．78．17．88．88．27．98．98．38．09．08．48．19．18．58．29．28．68．39．38．78．49．48．88．5

（6）常用缓冲液的pKa值

缓冲液分子量pKa值缓冲范围Trisa12.18.087.1～7.9HEPESb283.37.477.2～8.2MPOSc209.37.156.6～7.8PIPESd304.36.766.2～7.3MESe195.26.095.4～6.8

a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。

7．温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系pKa(20℃)△pKa/10℃Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280

1．溶菌酶

用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。

2．蛋白水解酶类

　贮存液贮存温度反应浓度反应缓冲液温度预处理0.01mol/L Tris(pH7.8)链霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37℃自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/ml0.005mol/L EDTA37～56℃无须预处理0.5% SDS

a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomycesgriseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./lTris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。

c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。

3．无DNA酶的RNA酶

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

抗生素贮存液a工作浓度浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml羧苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-20℃25μg/ml170μg/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml链霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml四环素b5mg/ml(溶于乙醇)-20℃10μg/ml50μg/ml

a：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

1．30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】

将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

【注意】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。

在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

2．40%丙烯酰胺

【配制方法】

把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。

【注意】

见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

3．放线菌素D溶液

【配制方法】

把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

【注意】

放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液

【配制方法】

在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃

5．10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】

把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

6．10%过硫酸铵溶液

【配制方法】

把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。

7．BCIP溶液

【配制方法】

把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

8．2×BES缓冲盐溶液

【配制方法】

用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl调节　该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。

9．1mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。

【注意】

制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。

10．2.5mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

【配制方法】

用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

【注意】

DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

【配制方法】

把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。

碱基波长（nm）消化系数（ε）[L/（mol·cm）]A2591.54×104G2531.37×104C2719.10×103T2607.40×103

比色杯光径为1cm时,吸光度=εM

13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液

【配制方法】

在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节　溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

【注意】

EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。

14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）

【配制方法】

在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

【注意】

小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

15．2×HEPES缓冲盐溶液

【配制方法】

用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4·2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH调节　pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。

16．IPTG溶液

【配制方法】

IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

17．1mol/L乙酸镁溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。

18．1mol/L MgCl2溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解203.4gMgCl2·6H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。

【注意】

MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。

19．β-巯基乙醇（BME）溶液

【配制方法】

一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4℃。

【注意】

BME或含有BME的溶液不能高压处理。

20．NBT溶液

【配制方法】

把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。

21．酚/氯仿溶液

【配制方法】

把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液层，保存于4℃。

【注意】

酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液

【配制方法】

用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。

【注意】

PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节　为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液

【配制方法】

在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调节　溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。

24．1mol/L乙酸钾（pH7.5）溶液

【配制方法】

将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节　pH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20℃。

25．乙酸钾溶液（用于碱裂解）

【配制方法】

在60ml 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。

26．3mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液

【配制方法】

在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节　pH值至5.2或用稀乙酸调节　pH值至7.0，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

27．5mol/L NaCl溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。

28．10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液

【配制方法】

在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节　溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。

【注意】

SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。

29．20×SSC溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节　pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

30．20×SSPE溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6g NaH2PO4·H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液调节　pH值至7.4（约需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。

31．100%三氯乙酸溶液

【配制方法】

在装有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。

32．1mol/L Tris溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解121.91gTris碱，加入浓HCl调节　pH值至所需值。

pH　HCl

7.4 70ml

7.6 60ml

8.0 42ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

【注意】

如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。

尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。

Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6。

33．Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris）

【配制方法】

在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。

34．X-gal溶液

【配制方法】

X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。

杂交试验中用于降低背景的封闭剂

试剂用途Denhardt试剂Northern杂交使用RNA探针的杂交单拷贝序列的Southern杂交将DNA固定于尼龙膜上的杂交Denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500ml。BLOTTOGrunstein-Hogness杂交Benton-Davis杂交除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交斑点印迹1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有RNA酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素Southern杂交原位杂交肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。经变性并被打断的鲑精DNAsouthern和Northern杂交把鲑鱼精子DNA（Sigma,Ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的OD260值并计算出精确的DNA浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA

1．葡聚糖凝胶的某些技术数据

种类干颗粒直径（μ）分子量分级范围床体积毫升/克干分子筛得水值溶胀最少平衡时间（h）柱头压力（kPa）(2.5cm直径柱)肽及球形蛋白质葡聚糖（线性分子）室温沸水浴Sephadex G-1040～ 120～700～7002～ 31.0±0.131　Sephadex G-1040～ 120～150015002.5～3.51.5±3.531　Sephadex G-25　　　　　　　　粗级100～300

(≈5～100目)　　　　　　　中级50～150

(≈100～200目)1,000～

5,000100～

5,0004～61.5±0.262 细级20～800(≈200～400目)　　　　　　　超细10～40　　　　　　　Sephadex G-50　　　　　　　　粗级100～200　　　　　　　中级50～1501,500～500～　　　　　细级20～8030,00010,0009～115.0±0.362 超细10～40　　　　　　　Sephadex G-75　　　　　　　　　40～1203,000～1,000～　　　　　超细10～4070,000950,00012～157.5±0.52433.92～15.86Sephadex G-100　　　　　　　　　40～1204,000～1,000～　　　　　超细10～401,500,000150,00015～2010.0±1.04852.35～9.41Sephadex G-150　　　　　　　　　40～1205,000～1,000～20～30　　　　超细10～40400,000150,00018～2215.0±1.57250.88～3.53Sephadex G-200　　　　　　　　　40～1205000～1000～30～40　　　　　10～40800,000200,00020～2520.0±2.07250.39～1.57

2.聚丙烯酰胺凝胶的技术数据

型号排阻的下限

(分子量)分级分离范围

(分子量)膨胀后的床体积(ml/g干凝胶)膨胀所需最少时间(室温,h)Bio-gel-P-21,600200～2,0003.82～4Bio-gel-P-43,600500～4,0005.82～4Bio-gel-P-64,6001,000～5,0008.82～4Bio-gel-P-1010,0005,000～17,00012.42～4Bio-gel-P-3030,00020,000～50,00014.910～12Bio-gel-P-6060,00030,000～70,00019.010～12Bio-gel-P-100100,00040,000～100,00019.024Bio-gel-P-150150,00050,000~150,00024.024Bio-gel-P-200200,00080,000～200,00034.048Bio-gel-P-300300,000100～400,00040.048

3．琼脂糖凝胶的技术数据

型号琼脂糖含量

%（W/W）排阻的下限

（分子量）分级分离的范围（分子量）生产厂家Sepharose 4B4　0.3×106～3×106PharmaciaSepharose 2B2　2×106～25×106Sagavac 10102.5×1051×104～2.5×105SeravacSagavac 887×1052.5×104～7×105Sagavac 662×1065×104～2×106Sagavac 4415×1062×105～15×106Sagavac 22150×1065×105～15×107Bio-gel A-0.5M100.5×106<1×104～0.5×106Bio-RadBio-gel A-1.5M81.5×106<1×104～1.5×106Bio-gel A-5M65×1061×104～5×106Bio-gel A-15M415×1064×104～15×106Bio-gel A-50M250×1061×105～50×106Bio-gel A-150M1150×1061×106～150×106

4．各处凝胶所允许的最大操作压

凝胶最大静水压（kPa）Sephadex　G-109.8G-159.8G-259.8G-509.8G-754.9

5．琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp）0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～2000

6．染料在变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度

凝胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青FF5．035bp140bp6．026bp106bp8．019bp75bp10．012bp55bp20．08bp28bp

7．染料在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度

凝胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青FF3.5100bp460bp5.065bp260bp8.045bp160bp12.020bp70bp15.015bp50bp20.012bp45bp

氨基酸名称三字母缩写单字母缩写质量侧链电离的pHa值结构式丙氨酸（alanine）AlaA89.09　精氨酸（arginine）ArgR174.212.48天冬酰氨（asparagine）AsnN132.1　天冬氨酸（aspartic acid）AspD133.13.86半胱氨酸（systeine）CysC121.12　谷氨酰胺（glutamine）GlnQ146.15　谷氨酸（glutamic acid）GluE147.134.25甘氨酸（glycine）GlyG75.07　组氨酸（histidine）HisH155.166.0异亮氨酸（isoleucine）lleI131.17　亮氨酸（leucine）LeuL131.17　赖氨酸（lycine）LysK146.19　甲硫氨酸（methionine）MetM149.21　苯丙氨酸（phenylanaline）PheP165.19　脯氨酸（proline）ProP115.13　丝氨酸（serine）SerS105.06　苏氨酸(threonine)ThrT119.12　色氨酸（tryptophan）TrpW204.22　 酪氨酸（tyrosine）TyrY181.1910.07缬氨酸（valine）ValP117.15　

密码子的第二位

密码子的第一位（5’端）　UCAG　密码子的第三位（3端’）UUUUPheUCUSerUAUTyrUGUGysUUUCPheUCCSerUACTyrUGGGysCUUALeuUCASerUAA终止（赭石）UGA终止（乳白）AUUGLeuUGGSerUAG终止（琥珀）UGGTrpGCCUULeuCCUProCAUHisCGAArgUCUCLeuCCCProCACHisCGCArgCCUALeuCCAProCAAGlnCGAArgACUGLeuCCGProCAGGlnCGCArgGAAUUIleACUThrAAUAsnAGUSerUAUCIleACCThrAACAsnAGCSerCAUAIleACAThrAAALysAGAArgAAUGMetACGThrAAGLysAGCArgGGGUUValGCUAlaGAUAspGGUGlyUGUCValGCCAlaGACAspGGCGlyCGUAValGCAAlaGAAGluGGAGlyAGUGValGCGAlaGAGGluGGGGlyG

1．